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图片来源: https://en.wikipedia.org/wiki/Fusion_gene

写在前面

下面主要内容是关于RNA-seq数据分析融合，用到软件是FusionMap 【FusionMap参考文献】。

融合分析使用哪个软件，哪个软件表现较好，在Biostarts发现一个问答列举了一些软件（看这里），里面有STAR-Fusion, STAR-Fusion, deFuse, FusionCatcher等30多个融合分析软件，其中约20多个软件的文献发表于2011-2013年，FusionMap软件的文献也发表与2011年。还有几篇软件比较的文献，各分析软件的优劣文献中也会提，晚一些发表的文献也会与之前发表的软件作比较。

另外，FusionMap软件应该很早不再更新了，是在Oshell工具包中进行维护。

FusionMap融合检测原理

融合Reads：Seed reads和Rescued reads

融合方向：图来源

FusionMap与其他软比较

图片来源文献: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4797269/

上面表格红色标注是，相对FusionMap, 结果比FusionMap差的。从该文献给的上表中粗略看，FusionMap在三组和构造的数据集上表现还可以，而在乳腺癌和黑色素瘤的样本数据上表现较差，对它的综合评价属于中等程度，但它有个最大的好处，就是用C#编写，其运行速度较其他软件要快。

对于该软比较文献中，具体使用的是什么样的数据，各软件分析时使用的参数，比较的评分标准，可能对各个软件都会有影响。

FusionMap分析流程

软件分析流程pipline：图来源

融合检测流程：

其中，序列比对是在GSNAP软件基础上进行了一些改进。介绍GSNAP

（1）分析流程配置oscript文件示例：

http://www.arrayserver.com/wiki/index.php?title=OmicScript_example_for_RNA-Seq_data_analysis_pipeline

（2）软件使用示例：

mono oshell.exe --runscript Base_Dir Script_path/buildIndex.oscript Temp_Dir Mono_Path

FusionMap结果文件说明

结果文件report：http://www.arrayserver.com/wiki/index.php?title=Fusion_SE_report

表头名称	含义
FusionID	融合ID信息，格式为: FUS_Start_END${}^{注[1]}$
Bam.UniqueCuttingPositionCount	Uniq read数，相当于Seed Reads+Rescued reads的去重
Bam.SeedCount	如上图中，假设$\alpha$就是一端softclip长度最小值，则SeedCount则为softclip长度>=α的Reads数。(如果值比较小，也可能根本比不上）目的是这些Reads可作为种子序列扩展成较长的融合序列，再将扩展的融合序列作为自构建ref，比较靠边缘的融合序列比对到自构建ref。如果是PE150bp，$\alpha =25$，最多可扩展成125+125=250bp的融合序列
Bam.RescuedCount	相当于softclip长度<α的reads数，通过SeedReads自构建的ref进行比对上的reads
Strand	链方向
Chromosome1	断点1染色体
Position1	断点1位置
Chromosome2	断点2染色体
Position2	断点2位置
KnownGene1	断点1基因
KnownTranscript1	断点1转录本
KnownExonNumber1	断点1外显子号
KnownTranscriptStrand1	断点1基因链方向
KnownGene2	断点2基因
KnownTranscript2	断点2转录本
KnownExonNumber2	断点2外显子号
KnownTranscriptStrand2	断点2基因链方向
FusionJunctionSequence	融合断点上下游（30bp）序列
FusionGene	融合两端基因
SplicePattern	融合剪接模式 [1]
SplicePatternClass	融合剪接模式类型 [1]
FrameShift	发生frameshift的格式 [2]
FrameShiftClass	frameshift的类型 [2]
Distance	融合断点间距离（不是同一染色体时为-1）
OnExonBoundary	是否在Exon边界，None：两个断点都不在；Both：两个断点都在；Single：有一个断点在。
Filter	可过滤信息，包括：InFamilyList(家族基因列表)/InBlackList(黑名单列表)

其中：

[1] SplicePatternClass包括：

• CanonicalPatter[Major]: GT-AG SplicePattern
• CanonicalPatter[Minor]: GC-AG and AT-AC SplicePattern
• NonCanonicalPatter: all other detected di-nucleotides

[2] FrameShiftClass包括：

• FrameShift：融合处发生了移码。
• InFrame：融合处是整码（断点处基因的碱基是3的倍数）。

FrameShift对应值的格式为: [0{0,1}1{0,1}2{0,1}->0{0,1}1{0,1}2{0,1}（python正则表达式，0{0,1}是指0字符出现0-1次）

• （1）若值为->或->0{0,1}1{0,1}2{0,1}或0{0,1}1{0,1}2{0,1}->（例如，->0/->01/->012），可能是融合比对的位置两个断点或一端断点不在编码区？【InFrame】
• （2）若值为0->1或1->2或2->0（下图），表示两个基因融合后，没有发生移码【 InFrame】
• （3）若值为0->2/0->0、1->0/1->1或2->1/2->2，表示两个基因融合后，发生了移码 【FrameShift】
• （4）若值为->左端或右端有多种模式，例如02->2，012->1。当多种模式都包含在情形（3）中，则为【FrameShift】，例如：0->02、01->0、02->2、1->01、12->1、2->12；当多种模式中至少有一种属于情形（2），则为【InFrame】，例如：0->012、0->01、01->01等。

图来源 也介绍了fusionMap检测融合：

推荐的过滤条件：图来源

SeedCount >= 3； SplicePatternClass =CanonicalPattern[Major] or CanonicalPattern[Minor] ； Filter=Empty
更严格的条件：FrameShiftClass=InFrame；OnExonBoundary=Both

单端/双端融合的基因表达结果：图来源（oscript配置中设定分析表达步骤）

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FusionMap mono CUP设置

占用较高CPU问题，如何设置？【还不清楚】

• FusionMap使用说明文档

• 关于FusionMap的一些安装说明中提到控制文档示例中，有提到mono的一些参数设置：（但不知道在哪里设置该文件？）
  

Mono的帮助文档中有相关参数：

参数	说明
–aot
环境变量：
MONO_CPU_ARCH	覆盖自动 CPU 检测机制。目前仅用于arm, eg：MONO_CPU_ARCH="armv4 thumb" mono ...
MONO_THREADS_PER_CPU	一般线程池中的最大线程数将为 20 + (MONO_THREADS_PER_CPU * CPU 数)。此变量的默认值为 10
MONO_TLS_SESSION_CACHE_TIMEOUT	SSL/TLS 会话缓存将保留其条目以避免客户端和服务器之间的新协商的时间（以秒为单位）。协商非常占用 CPU，因此特定于应用程序的自定义值可能证明对小型嵌入式系统有用。默认值为 180 秒。

其他参考：

• github上mono相关问题MONO_THREADS_PER_CPU=100 参考
• 在linux上使用mono跑c#的程序一定要特别注意，while（true）的问题（使用sleep）参考
• 配置supervisor来管理mono程序 参考
• https://www.mono-project.com/docs/
• 融合发生机制及检测方法

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