Chip-seq数据分析处理流程

一、处理过程

要处理 SRR14879780 的 ChIP-seq 数据并进行基序分析（包括比对到参考基因组 hg38.fasta 和峰值调用），你可以按照以下步骤操作，并使用相应的代码。每个步骤会涉及一些常用的生物信息学工具，如 FastQC、Trim Galore、Bowtie2、samtools、MACS2 和 MEME-ChIP。

1. 准备环境

你需要先安装必要的工具，如 Bowtie2、samtools、MACS2 和 MEME-ChIP。你可以使用 conda 来安装这些工具：

# 使用conda安装工具
conda install -c bioconda fastqc trim-galore bowtie2 samtools macs2 meme

2. 下载数据

首先，下载你需要的原始 SRA 数据 和 hg38 参考基因组。

# 下载sra数据并转换为fastq文件
prefetch SRR14879780
fastq-dump  SRR14879780.sra
fasterq-dump SRRxxxxxx #比 fastq-dump 更快速的工具，适用于大数据集。# 下载hg38参考基因组并建立索引
wget https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/hg38.fa.gz  #下载hg38
gunzip GCF_000001405.40_GRCh38.p14_genomic.fna.gz  #解压下载的fasta文件
samtools faidx hg38.fa  #为fasta文件建立索引
less hg38.fa  #查看fasta文件

3.截取使用到的参考数据

samtools faidx hg38.fa chr20 > hg38_chr20.fa  #截取需要比对的部分参考序列

（可选）数据质量控制和修剪

在对数据进行处理前，先检查测序数据fastq的质量，使用 FastQC 进行质控分析：

# 质量控制
fastqc SRR14879780_1.fastq# 使用Trim Galore修剪低质量reads
trim_galore --paired SRR14879780_1.fastq SRR14879780_2.fastq

4. 比对生成sam

为了将数据比对到参考基因组，你需要构建参考基因组的索引，然后和fastq比对生成sam。

bwa index hg38_chr20.fa  # 为 使用到的参考数据hg38_chr20.fa建立索引
bwa mem -t 24 hg38_chr20.fa SRRxxxxxx.fastq > SRRxxxxxx_hg38_chr20.sam  # 将 FASTQ 数据比对到 chr20中的序列生成sam文件

5.sam文件压缩为bam文件，然后为bam文件建立索引

samtools sort -@ 24 -o SRR_chr20.bam SRR_chr20.sam   # 将sam文件压缩为bam文件samtools index SRR_chr20.bam #为bam文件建立索引

（可选）使用picard去除重复数据

使用conda创建一个虚拟环境，在该虚拟环境中安装picard

picard MarkDuplicates I=input.bam O=output.bam M=marked_dup_metrics.txt

（可选）用 bedtools 移除 ENCODE 项目中定义的黑名单区域

这里的黑名单区域指的是适用于 hg38 基因组版本的 ENCODE 黑名单区域的 bed 文件，先去encode中下载黑名单区域的bed文件

bedtools intersect -v -a your_data.bam -b hg19-blacklist.bed > filtered_data.bam

（可选） bamCoverage生成标准化的覆盖度轨迹BigWig 文件

effectiveGenomeSize指的是有效基因组大小，指的是在测序分析中用于正常化的基因组的可测序区域的总长度（以碱基对为单位）。有效基因组大小与基因组的物理大小不同，通常排除了重复序列、未测序区域、基因组黑名单区域等不可测序或不可靠的区域。对于人类基因组，常见的基因组版本的有效基因组大小如下：hg19: 2,733,156,957 bp；hg38: 2,916,115,550 bp

bamCoverage -b SRR14879760_chr20_NOP56_sorted.bam -o SRR14879760_chr20_NOP56_sorted.bw --normalizeUsing RPGC --effectiveGenomeSize 2914744149 --binSize 5

6. 峰值调用

使用 MACS2 对比对的 BAM 文件进行峰值调用，以识别可能的 G4 结构富集区域：

# 使用MACS2进行峰值调用
macs2 callpeak -t SRR14879780_sorted.bam -f BAM -g hs -n SRR14879780_peak --outdir peaks/ --keep-dup all --cutoff-analysis --qvalue 0.001

7.高置信度峰值集

• 使用 Bedtools 合并重复实验的峰值：为了确保峰值的可靠性，使用 Bedtools 的 intersect 命令合并三个重复实验（G4）或两个重复实验（R-loop）的峰值，生成高置信度的峰值集。

8. 绘制 Venn 图

• 使用 R 包 VennDiagram：将不同重复实验的峰值重叠区域通过 Venn 图进行可视化，展示不同条件下的峰值共现情况。

9. 统计学显著性测试

• 使用 GSuite HyperBrowser (v2.1.3)：通过 Monte Carlo FDR （假发现率）测试，评估峰值集合间的重叠显著性。这个测试可以确认不同数据集之间的峰值重叠是否具备统计学意义。

10. 基序分析

使用 MEME-ChIP 对 MACS2 调用的峰值进行基序分析：

# 提取峰值顶点区域的序列
bedtools getfasta -fi GCF_000001405.40_GRCh38.p14_genomic.fna -bed peaks/SRR14879780_peak_peaks.narrowPeak -fo peaks/SRR14879780_peaks.fa# 使用MEME-ChIP进行基序分析
meme-chip -oc motif_results/ peaks/SRR14879780_peaks.fa

bedtools getfasta：这是bedtools套件中的一个程序，用于从FASTA文件中提取与BED文件指定的区域相对应的序列。fi：指定输入的FASTA文件路径，bed：指定输入的BED文件路径，fo：指定输出的FASTA文件路径

meme-chip基序分析：可以使用在线工具MEME-ChIP - Submission form (meme-suite.org)

 结果分析

• MACS2 输出文件：你会得到 .narrowPeak 文件，包含了调用到的峰值位点。
• MEME-ChIP 输出文件：你会在 motif_results/ 目录下得到基序分析的结果，展示在G4区域内富集的序列基序。

总结：

以上步骤详细展示了如何处理 SRR14879780 的 ChIP-seq 数据，使用 hg38 参考基因组进行比对、峰值调用，以及对富集区域进行基序分析。

二、文章中对chip-seq处理的描述

这段描述了 G4 ChIP-seq 实验 的具体流程，以及后续的数据处理步骤。以下是它的详细解释：

1. 实验步骤：

• 固定和染色质剪切：使用交联固定（通常是使用甲醛等）稳定DNA和蛋白质之间的相互作用，然后对染色质进行超声或其他方式的剪切，使其成为可处理的小片段。
• Triton X-100 处理：在固定和剪切后，加入 0.25% Triton X-100 处理样品，并以 20,000 g 的离心力离心10分钟，以去除不溶性碎片。
• 免疫沉淀（IP）：从剪切后的染色质中提取 12.5 μL 样品，并使用 800 ng BG4 抗体（特异性识别 G-四链体结构的抗体）进行免疫沉淀。
• 洗涤：使用含有 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)、100 mM KCl 和 0.1% Tween-20 的洗涤缓冲液，在 37℃ 和 1,400 rpm 的旋转孵育器中洗涤捕获的染色质片段10分钟，以去除非特异性结合的物质。
• DNA 洗脱和反交联：捕获的DNA通过 TE缓冲液 和 蛋白酶K 洗脱，并通过 65℃ 反交联（去除蛋白质-DNA的交联），纯化得到的DNA。
• DNA 纯化：使用 苯酚-氯仿 提取法和 乙醇沉淀 方法进一步纯化 DNA。

2. 测序库构建和测序：

• 使用 NEBNext ultra II DNA library prep kit 为 Illumina 平台制备 G4 ChIP-seq 文库，文库质量通过 Agilent 生物分析仪 进行评估，最后在 NovaSeq 6000 上进行测序。

3. 数据处理：

• 比对：使用 Bowtie 1.1.2 将测序读数比对到人类基因组（UCSC hg38），仅允许唯一映射的读段，并且在每个150 bp长的读段中最多允许3个错配。
• 读段扩展和归一化：比对的读数扩展到200 bp，模拟片段的实际长度，然后将读数归一化为每百万映射的读数（reads per million, r.p.m.）。
• 峰值调用：使用 MACS2 工具（ChIP-seq 的峰值分析模型）调用G4信号的峰值，参数设置为默认，q-value（显著性阈值）为 0.001，以识别基因组中的显著富集区域。

4. 基序分析：

• 峰值扩展：为了进行基序（motif）分析，作者将已调用的G4 ChIP-seq峰值的顶点（峰值的中心）扩展50 bp，从这些区域提取DNA序列。
• MEME-ChIP：使用 MEME-ChIP（一种基序发现工具）对这些DNA序列进行分析，找出可能的特征基序（motif）。

总结：

该段描述了 G4 ChIP-seq 实验的整个过程，从样品制备、免疫沉淀到 DNA 纯化和测序库构建。接着介绍了如何使用 Bowtie 将测序数据比对到参考基因组，如何通过 MACS2 调用 G4 的富集区域（峰值），以及使用 MEME-ChIP 进行基序分析。这些步骤有助于识别基因组中可能形成 G-四链体结构的区域，并分析其功能。