羊驼免疫制备纳米抗体

        纳米抗体（nanobodies，Nbs）是由比利时科学家Hamers等人在骆驼血液内首次发现的一种新型抗体，与传统抗体相比，这种抗体不存在轻链，只有重链抗体（HcAb）和两个常规的CH2和CH3区组成，分子量只有15 KDa左右，被称为纳米抗体。HcAb 的特异性仅依赖于称为 VHH 的重可变域。VHH 的重组产物被称为单域抗体 (sdAb) 或纳米抗体的片段[1]。

一、纳米抗体相对传统抗体的优势：

（1）和靶点结合特异性更强；

（2）更高的组织穿透力；

（3）更高的稳定性如耐高温；

（4）适合工业化大规模生产；

（5）更容易改造和优化；

（6）更容易人源化；

二、纳米抗体的制备方法

          传统单克隆抗体通常用杂交瘤的方法进行制备，而纳米抗体则多通过噬菌体展示技术进行制备。

        噬菌体展示技术（即：纳米抗体技术）是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入M13噬菌体的P3蛋白基因序列的适当位置，以达到外源基因随噬菌体外壳蛋白的表达而在噬菌体表面进行展示的目的。噬菌体展示的优势在于其展示纳米抗体文库中变异抗体基因的多样性，各个重组噬菌体（常用噬菌体为M13噬菌体）表面展示出不同的抗原结合域，相较于传统杂交瘤方法，噬菌体展示技术在抗体基因展示与筛选层面则具有非常突出的效率优势（如杂交瘤融合效率一般<0.4%，即1000次融合细胞中，大概4个融合子；而噬菌体展示轻松可以获得108-109个正确抗体序列）。

三、纳米抗体的制备流程

      纳米抗体的制备流程主要分为羊驼免疫，噬菌体文库构建，筛选抗体库、抗体表达与功能验证四个步骤[2]。

      为了建立免疫库，首先必须给年轻的、健康的美洲驼、单峰骆驼、羊驼等进行免疫。通常，在2个月的时间跨度内，动物被注射4-8次目标抗原和佐剂的混合物。一般每次注射约50-200μg免疫原；确切数量显然取决于抗原分子量，更取决于其免疫原性和/或毒性。

      免疫原类型：使用可溶性、正确折叠的重组蛋白是首选推荐，也有直接DNA免疫。通常混合多达10种蛋白质来免疫动物，但更复杂的混合物也有被使用（例如：病毒、细菌、寄生虫、完整的小鼠脾细胞或癌细胞的蛋白质提取物）[3]。

       为了增加特定表位成功获得纳米抗体的可能性，建议对一个以上的动物进行免疫。它们是近系繁殖的动物，每一个动物都会产生独特的免疫反应，获得更大的纳米抗体 panel，从中选择表现最好的纳米抗体。

       一些研究显示，与美洲驼和羊驼相比，骆驼或单峰骆驼中HCAb抗体比经典抗体的比例更高。免疫接种后，取50-100毫升抗凝血（通常来自颈静脉，尽管淋巴结活检也是一种很好的原料），制备淋巴细胞和提取mRNA。将mRNA转化为cDNA，用于扩增VHH基因（两步巢式PCR）。

       一些分子，如RNA或DNA，没有免疫原性，不能刺激产生HCAb，或者有些化合物毒性太大、传染性太强或对动物或环境有害，在这种情况下，可以设想构建一个天然纳米抗体库或一个合成的纳米抗体库。

        为了能够筛选到高亲和力的纳米抗体，天然抗体库的大小一般达到109-1010，其中80%左右应该编码纳米抗体。为了构建这样一个大而多样的天然纳米抗体库，需要从多个动物收集血液(至少10只动物，以避免由于过敏或以前感染导致的HCAbs产生偏差)。预计每mL血液有106个淋巴细胞，而只有一小部分是B细胞，并且约50%可能表达HCAb，所以需要10L血液来构建1010个不同VHH克隆的纳米抗体库。

      卡梅德生物（KMD Bioscience）(https://www.kmdbioscience.cn/)建立了一个完善的、成熟的噬菌体抗体展示技术平台。基于噬菌体展示技术平台，卡梅德生物可以提供包括抗原设计、羊驼免疫、文库构建与筛选、活性功能验证等主要实验环节，并为全球的科学家提供高特异性和高亲和力的羊驼VHH抗体。此外，卡梅德生物拥有丰富的抗体工程构造经验，能够进行立体化的抗体上下游服务，包括抗体人源化服务、人源scFV抗体库构建服务、人源Fab抗体文库构建服务、人源抗体噬菌体文库制备服务以及磷酸化抗体定制服务、抗体亲和力成熟服务等，满足不同客户的科研要求。

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参考文献：

1. Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annu Rev Biochem. 2013;82:775-97.
2. De Genst E, Saerens D, Muyldermans S, Conrath K. Antibody repertoire development in camelids. Dev Comp Immunol. 2006;30(1-2):187-98.
3. Rossotti MA, Trempe F, van Faassen H, Hussack G, Arbabi-Ghahroudi M. Isolation and Characterization of Single-Domain Antibodies from Immune Phage Display Libraries. Methods Mol Biol. 2023;2702:107-147.